动物腹腔镜技术在牛体外受精中卵母细胞的收集（活体采卵）上的应用

腹腔镜技术采取卵母细胞的回收率与直接从卵巢采卵相比操作简便，此外还可通过腹腔镜进行卵泡发育情况的检查。

操作方法：

腹腔镜的插入：将钝头套针插入套管，把套管插入阴道，通过直肠把握将套管前端定位于阴道穹隆预定部位，然后撤出钝头套针，插入棱锥套针，并调整角度。使套针的方向与牛的长轴略向右呈10°的夹角，向上用力穿透阴道穹隆。如阻力突然减少，则表明已经刺穿阴道穹隆，此时取出套针，当听见有空气进入的声音且直肠把握的手同时感到腹腔的膨胀，则表明刺入的位置正确，即可将消毒后的带有内窥镜筒的不锈钢鞘插入套管中去。根据直肠把握的感觉，若感到腔较小，则需充入一些CO2，进气的速度一般应控制在,7~L/min,充入的气体的多少因牛只的大小而定"一般为9L左右。

卵母细胞的采集：直肠把握操作者应不断地调整腹腔镜与卵巢的位置，展示卵巢上不同位置卵泡及黄体的形态，以便确定需要穿刺的卵泡。一名助手根据直肠把握操作者的口令和屏幕上显示的卵泡，操作穿刺针，采集卵泡液，将卵泡液放入事先加入少量培养液的收集管中。另一名助手负责操作脚踏真空泵，为了防止卵母细胞的流失，真空泵的启动（负压应在100mm汞柱)应先于穿刺。收集后卵泡液静置于试管架5~10min后，用吸管吸取收集管底部的卵泡液到平皿中，然后在光学显微镜下观察。并将检出的卵母细胞吸入到细管中。封闭好细管的两端，卵母细胞即可运输到实验室进行成熟培养。操作完成后，将内窥镜镜筒取出，由两名助手按压母牛两侧腹壁排出腹腔内气体，到气体不再排出为止，再取出套管，隔日进行阴道检查，防止出现感染。

注意事项：

1、麻醉方面：不可过浅或过深。有效的麻醉是完成卵泡穿刺获取卵母细胞的先决条件。 麻醉过浅，牛有痛感，在操作时不安、挣扎，会影响操作的准确性，要补充麻醉。 麻醉过深，牛只站立不稳，甚至卧下，也影响操作。如牛只卧下，应立即停止操作，迅速撤出套管和腹腔镜筒，同时还应注意及时解除保定，避免牛只的受伤。

2、穿刺方面：直肠把握者在穿刺阴道穹隆时应正确把握刺入角度，防止刺穿直肠和大肠。在穿刺卵泡时，针头不宜刺的过深，否则会伤及卵巢实质，造成出血，这不仅会污染卵泡液，影响卵母细胞的检出，堵塞针头和导管，而且还会影响卵巢上卵泡的恢复。 如遇出血，应立即停止卵泡穿刺，更换针头和导管及采集管，并用0.01mg肝素/ML生理盐水冲洗针头及导管，方可进行下一个卵泡穿刺。

3、采集卵泡液方面：采集的卵泡液应尽量保持恒温，最好采集后立即检出卵母细胞，并放入含有FSH的成熟培养液内，包装在细管中运送至实验室，一般从采出到放入培养箱进行成熟培养的时间不宜超过4h。

4、技能方面：成功地运用此方法，不仅需要良好的设备，还要求操作者具有较高的知识水平及熟练的实际操作能力，同时还需要与两名助手密切配合。因此，在实验操作前必须要进行必要的培训。

另外，还可以通过此方法从青年母牛体内提早获取卵母细胞，从而提高母牛的利用期限和繁殖潜力，加速遗传进展。该方法将是继超数排卵和离体卵巢的利用技术之后的有一获取卵源的好方法。

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